艾灸通過調(diào)節(jié)滑膜G蛋白偶聯(lián)受體43和輔助性T細胞17/調(diào)節(jié)性T細胞平衡改善佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜炎的研究
類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA)是一種以進行性關(guān)節(jié)破壞和高致殘率為特點慢性炎癥性疾病，并常伴有一系列關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，包括心血管疾病、肺部疾病、胃腸道疾病等，是一個重要的公共衛(wèi)生問題。
艾灸作為傳統(tǒng)的外治方法，治療RA較為安全，幾乎無副作用，且具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，目前研究發(fā)現(xiàn)艾灸能夠通過輔助性T細胞17（helper T cell， Th17）/調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell， Treg）平衡改善RA關(guān)節(jié)癥狀。
G蛋白偶聯(lián)受體43(g-protein-coupled receptor 43，GPR43)是一種重要的短鏈脂肪酸受體，在腸道、脂肪組織和免疫系統(tǒng)中均有表達，參與調(diào)節(jié)食欲和胃腸道肽分泌以調(diào)節(jié)脂肪分解和形成。
研究表明，GPR43的新型變構(gòu)激動劑能夠減輕炎癥，支持了其作為治療藥物對各種炎癥性疾病的臨床實用性，且GPR43能夠調(diào)節(jié)外周來源的Treg水平。
Treg和Th17與RA疾病活動密切相關(guān)，Treg可通過分泌具有抗炎信號傳導特性的抑制性細胞因子來影響免疫耐受，降低炎性反應，如白介素-10（Interleukin 10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）；而Th17細胞能夠分泌白介素-17（interleukin 17，IL-17)，引發(fā)滑膜的炎性反應。
但目前艾灸是否能夠通過GPR43調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡并未得到驗證，故本研究建立 AA 大鼠模型，觀察艾灸“足三里”“腎俞”對 AA 大鼠滑膜組織GPR43相對表達量，外周血Th17/Treg，血清IL-10、TGF-β1水平的影響，探討艾灸治療RA的可能機制。
健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量（190~210）g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2020-0001]。
動物飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學動物實驗室，實驗室溫度為21~25 ℃、濕度為 40% ~60%，食用正規(guī)鼠用飼料及滅菌自來水。
適應性喂養(yǎng)7d后采用隨機數(shù)字表法將24只Wistar大鼠分為正常組、模型組、艾灸組，每8只。
本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的批準(倫理編號：No.AHUCM-rats-2022139)，實驗嚴格遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的相關(guān)規(guī)定。
20%烏拉坦溶液（上海源葉），弗氏完全佐劑（CFA，美國Sigma），蘇木精染液、醇溶伊紅染液（安徽Ebiogo），乙級染色劑（德國Electron Microscopy Sciences），戊二醛、鋨酸（美國Ted Pella Inc），GAPDH（北京Zsbio），GPR43（英國Abcam），藻紅蛋白（PE）標記的分化決定簇抗原3 （CD3 ）、異硫氰酸（FITC）標記的分化決定簇抗原4（CD4 ）、
別藻藍蛋白（APC）標記的白介素-2受體α亞基（CD25 ）、藻紅蛋白（PE）標記的叉頭框蛋白P3（FOXP3 ）、核內(nèi)染色套裝（美國Biolegend），IL-17A-APC（美國Thermo），大鼠IL-10、大鼠TGF-β酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（武漢基因美科技）。
YB-7LF生物組織包埋機（湖北亞光），ZT-12M生物組織自動脫水機（湖北亞光），CX41顯微鏡（日本Olympus），JEM1400透射電鏡（日本電子），morada G3數(shù)碼相機記錄圖像（德國蒙斯特），pH計（上海梅特勒-托利多儀器），自動曝光儀（上海培清科技），流式細胞儀（美國Beckman），RT-6100酶標儀（深圳雷杜），JW3021HR離心機（安徽嘉文），足容積測量裝置（20 mL的無活塞注射器和5 mL的完全注射器之間用一根膠管相連）。
模型組和艾灸組采用風、寒、濕環(huán)境因素+ CFA注射的方法復制 AA 模型：將大鼠放置在自制造模箱內(nèi)，使箱內(nèi)溫度(6±2)℃，濕度80%~90%，風力定于高檔，持續(xù)20 d(12 h/d，20:00-8:00)，第21天于大鼠右后足趾部注射CFA(0.5 mL/只)致炎。
觀察3 d，至24 h大鼠雙側(cè)足趾炎性腫脹和顏色改變，48 h后出現(xiàn)雙側(cè)肢體或前肢、耳、尾部炎性結(jié)節(jié)或紅腫，表明造模成功。
正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。
模型復制后第7天，艾灸組進行干預，穴位定位參照《實驗針灸學》，大鼠剪去被毛，標色后，將其放置在特制懸空木架上固定，用艾條（直徑 0.5 cm、長度 20 cm，南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠）距穴位2 cm處懸灸，依次灸雙側(cè)“足三里”“腎俞”，刺激20 min，1次/d，7 d為1個療程，共3個療程。
正常組和模型組只進行相應抓取固定，不做其他干預。
關(guān)節(jié)腫脹度（joint swelling degree，JSD）測量：分別于干預前 1 d和干預最后 1 d，采用自制排水法測量各組大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)折以下的足趾容積。
計算其足跖腫脹度：JSD（%）=（Vt-Vn）/Vn×100%（Vn、Vt分別代表致炎前后足跖容積）。
關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評分：分別于干預前 1 d 和干預最后 1 d觀察并記錄。
按 5 級評分法評價：所有關(guān)節(jié)均無紅腫，0分；小趾關(guān)節(jié)紅腫，1分；趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹，2分；踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹，3分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，4分。
各關(guān)節(jié)積分求和即為大鼠的 AI 評分，總分為0 ~16分。
取材方法：干預結(jié)束后次日，每組取6只大鼠，腹腔注射20%烏拉坦溶液（0.5 mL/100 g）麻醉，腹主動脈取血3 mL，其中一部分用于流式細胞術(shù)，剩余部分離心20分鐘左右（2000~3 000 r/min）分離血清，用于酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測。
手術(shù)剪分離取出踝關(guān)節(jié)軟骨下附著的淡黃色光滑透亮的滑膜組織。
一部分供HE染色和透射電鏡觀察，其他液氮凍存用于蛋白質(zhì)印跡檢測。
HE染色觀察滑膜組織形態(tài)變化：取出部分滑膜組織，放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片（厚度約4 μm），脫蠟、乙醇脫水。
蘇木素浸染2~5 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗，飽和碳酸鋰溶液藍化數(shù)秒，流水沖洗，乙醇脫水，伊紅染液浸染數(shù)秒，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，×400光學顯微鏡下觀察滑膜細胞增生及炎細胞浸潤情況。
透射電鏡觀察滑膜組織形態(tài)變化：取部分滑膜組織，2.5%戊二醛固定24 h，PBS緩沖液浸泡6 h，1%鋨酸固定2 h后常規(guī)脫水包埋，45 ℃烤箱12 h、72 ℃烤箱24 h，制成超薄切片（片厚70 nm），銅網(wǎng)撈片，電子染色。
JEM1400型透射電鏡觀察滑膜組織超微結(jié)構(gòu)。
Western blot法檢測滑膜組織中GPR43蛋白表達：取備用滑膜組織樣本（約0.1 g左右），加入RIPA細胞裂解液，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱15分鐘，冷卻后，將樣品每孔加5~10 μL，恒壓80 V電泳，1 h。
轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗GPR43（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），4 ℃過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶20 000），室溫孵育1.2 h，再次洗膜后使用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。
Image J軟件進行條帶的分析。
以GAPDH作為內(nèi)參量，計算GPR43蛋白的相對表達量。
流式細胞術(shù)檢測外周血Th17和Treg百分比：腹主動脈取全血，加入相應的抗體，Th17(CD3，CD4)，Treg(CD4，CD25)，避光孵育15 min。
檢測Th17細胞加入固定劑和破膜劑后加入適量的IL-17A；檢測Treg細胞加入破核劑后加入適量的FOXP3，常溫避光20 min。
用PBS洗滌并重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測，F(xiàn)lowJo_V10分析Th17和Treg百分比。
ELISA法檢測血清IL-10及TGF-β1水平：腹主動脈取血，離心20分鐘左右（2 000~3000 r/min）分離血清。
嚴格按ELISA試劑盒說明書依次進行標準品及樣品加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色等操作，于450 nm波長測定各孔吸光度值，依照標準曲線方程計算血清中IL-10、TGF-β1含量。
采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計分析，Graphpad 8.0.1作圖。
采用均數(shù)±標準差（x±s）表示符合正態(tài)分布的數(shù)值變量資料，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用 LSD 法，方差不齊時則采用 Tamhanes T2 法。
以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義的標準。
造模后與正常組相比，模型組和艾灸組大鼠JSD、AI評分均顯著升高（P＜0.01），治療后與模型組相比，艾灸組大鼠的JSD、AI評分明顯降低（P＜0.01）。
采用HE染色和電鏡評價艾灸對AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的影響。
正常組大鼠滑膜細胞排列整齊，未見炎細胞浸潤；模型組大鼠滑膜細胞排列不整齊，增生活躍，有大量炎細胞浸潤；艾灸組大鼠滑膜細胞略有增生，浸潤炎細胞較模型組明顯減少。
正常組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞中細胞核膜核膜光滑完整，核染色質(zhì)相對致密均勻，線粒體形態(tài)規(guī)整、嵴突可見；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞中細胞核膜不清晰、不完整，染色質(zhì)固縮，細胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴被破壞；艾灸組滑膜細胞核膜較清晰光滑、核染色質(zhì)固縮不明顯，線粒體腫脹不顯著、嵴突可見。
實驗結(jié)果顯示，模型組AA大鼠滑膜組織中GPR43蛋白表達較正常組降低（P＜0.01）；艾灸組AA大鼠滑膜組織中GPR43蛋白表達較模型組升高，艾灸能夠提高AA大鼠滑膜組織中GPR43蛋白表達（P＜0.05）。
為了闡明艾灸對AA大鼠炎性反應的影響，我們檢測了大鼠的血液指標。
流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組AA大鼠外周血中Treg百分比降低，Th17百分比升高（P＜0.01）；與模型組比較，艾灸組AA大鼠外周血中Treg百分比升高，Th17百分比降低（P＜0.01）。
我們進一步檢測了AA大鼠血清中IL-10、TGF-β1的水平。
數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠血清IL-10、TGF-β1含量較正常組降低（P＜0.01）；艾灸組大鼠干預后血清IL-10、TGF-β1含量較模型組升高（P＜0.01）。
滑膜組織GPR43表達與外周血Treg表達的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示滑膜組織GPR43相對表達量與外周血Treg百分比存在線性相關(guān)關(guān)系（r=0.967，P＜0.01）。
類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）屬“痹證”范疇，與中醫(yī)古籍中所提到的“歷節(jié)”“鶴膝風”等癥狀相似。
《素問·痹論》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”，認為是風寒濕邪是痹證的重要病因病機，這奠定了中醫(yī)治療痹癥的理論基礎，又有《中藏經(jīng)·論骨痹》：“骨痹者，乃嗜欲不節(jié)，損腎也”，《脾胃論》：“內(nèi)傷脾胃……為諸濕痹”，可見RA與脾胃腎關(guān)系密切。
故本研究所選穴位為“足三里”與“腎俞”，足三里是胃腑之下合穴，是與免疫系統(tǒng)相關(guān)的重要穴位，具有補益氣血、扶正祛邪的作用；腎俞則為腎經(jīng)經(jīng)脈之氣輸注于背部之處，可補腎納氣、強筋健骨。
研究表明，近年艾灸治療寒濕痹阻型RA常用的腧穴以溫陽補腎、祛濕散寒為主，主要包括足三里、腎俞、阿是穴等。
且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)艾灸足三里、腎俞等穴位可調(diào)節(jié)免疫炎性反應，改善骨破壞，從而減輕RA的患者臨床癥狀。
Th17細胞的主要效應細胞因子是IL-17、IL-22，它們通過刺激抗菌肽和趨化因子的產(chǎn)生來吸引白細胞，引起自身免疫反應。
Treg細胞可通過分泌IL-10和TGF-β等抗炎細胞因子，抑制多種免疫細胞活性，從而發(fā)揮免疫抑制作用。
這兩種細胞在分化上相互抑制，在功能上相互拮抗，Th17細胞引起自身免疫，而Treg細胞抑制自身免疫，兩者共同維持機體免疫平衡，因此，Th17和Treg細胞的相互生成至關(guān)重要。
研究表明Treg在RA的發(fā)病機制中具有關(guān)鍵作用，其作用機制可能是通過產(chǎn)生一系列細胞因子（IL-10，TGF-β）抑制活化的免疫細胞。
本研究發(fā)現(xiàn) AA 模型組大鼠外周血Treg百分比較正常組降低，艾灸組AA大鼠外周血Treg百分比較模型組升高，這與以往的研究結(jié)果一致。
GPR43參與炎癥發(fā)生過程，是RA重要調(diào)節(jié)因子，它能夠降低IL-6、IL-8的表達，并呈劑量依賴性。
且GPR43被短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid， SCFAs)激活后，能夠使Treg增殖和抑制能力增強，包括產(chǎn)生IL - 10。
這些發(fā)現(xiàn)表明GPR43在調(diào)節(jié)RA發(fā)病機制方面具有重要的潛在能力。
本研究結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠JSD、AI評分、外周血Th17百分比升高，外周血Treg百分比、滑膜組織GPR43蛋白表達及血清IL-10、TGF-β1含量降低；與模型組相比，艾灸組大鼠JSD、AI 評分、外周血Th17百分比降低，外周血Treg百分比、滑膜組織GPR43蛋白表達及血清IL-10、TGF-β1含量升高，且滑膜組織GPR43相對表達量與外周血Treg百分比呈正相關(guān)關(guān)系。
綜上，艾灸“足三里”“腎俞”可能是通過GPR43調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，促進抑炎細胞因子IL-10、TGF-β1的分泌，從而改善 AA大鼠關(guān)節(jié)癥狀。
研究表明，SCFAs可能通過GPR43將信號傳輸給免疫細胞，促進初始T細胞向Treg細胞分化，增強Treg細胞的免疫抑制功能，發(fā)揮抗炎作用。
本研究亦觀察到AA大鼠GPR43的變化，因此艾灸是否通過影響SCFAs調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡發(fā)揮治療作用，還需進一步綜合研究。
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